NB/SH/T 0860-2013 液体燃料中活细菌和真菌计数的试验方法 过滤和培养程序
适用于液体燃料。
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适用范围
适用于液体燃料。 规定了采用膜过滤对常温条件下运动黏度不大于 24 mm²/s 的液体燃料的异养菌和真菌进行检测和计数的方法。 可在现场或实验室进行操作。 注：定量测试的试验部分主要来自 IP 385 及 ASTM D5259。 结果解释限制：个体微生物在特定培养基上形成菌落的能力取决于计数菌种的分类学和生态学状态、培养基的化学性质以及培养条件；测试结果不应作为对绝对数值的解释，而应根据 ASTM D6469 与其他的参数一同作为诊断和环境监控的一部分。 计数结果可作为诊断或常规监测的一部分，不作为燃料质量指标使用。 不适用：现有资料未提供明确列出"不适用"条款。
方法原理
将薄膜放在（过滤装置上），若试样含水，先将水脱除。将脱水后的一定体积的燃油试样以薄膜进行无菌过滤，过滤后的（薄膜）放在 MEA、TSA 两种琼脂培养基上，在特定的温度下培养 3d、5d 检测 CFU 的存在，并用手动或电动计数器对菌落进行计数。如果条件允许，在培养基上根据菌落颜色、形态和微观特征来识别菌落。 （注：原文该段 〔原文不清〕有噪声，"将薄膜放在"后及"过滤后的"后文字疑有缺漏，〔待核〕（〔原文不清〕）。）
主要仪器
分液漏斗：玻璃制，容量 500 mL。 7.2 量筒：玻璃制，容量 100 mL 和 1 L。 7.3 移液器：玻璃或经过预消毒的一次性塑料制，或使用带有一次性塑料头的可调节体积的移液器，体积 10 mL。 7.4 过滤薄膜：纤维素混合酯，经过预消毒的，网格状优先，直径 47 mm，孔径 0.45 μm。注：虽然推荐过滤膜材料是纤维素的混合酯，但薄膜材料的选择将取决于个人偏好和燃料类型。 7.5 过滤器，下面两种过滤器可任选其一： 7.5.1 消毒注射器：适当容量，带有预消毒的过滤器。 7.5.2 过滤器组件：经过预消毒处理的单个或多个的过滤器固定组件，玻璃、不锈钢或聚丙烯材质。注：如果选择真空过滤装置（7.5.2），应需要一个真空度不超过 -66 kPa 的真空源。 7.6 镊子：平头镊子。 7.7 抽滤瓶：足够容量盛装过滤样品及清洗溶剂。 7.8 培养皿：预消毒一次性的塑料或玻璃制，直径 ≥50 mm。注：预先加注培养基的培养皿可以在市场上买到也可以用来替代这里列出的培养皿。 7.9 细菌培养箱：可以实现 25 ℃±2 和其他温度的控制（温度在室温至 60 ℃ 可以调节），视情况选择。 7.10 水浴：温度控制在 47 ℃±2 ℃，能容纳 500 mL 烧瓶，至少容纳一瓶将使用的琼脂培养基。 7.11 玻璃瓶：螺旋盖不漏气的，规格 500 mL。 7.12 培养管：玻璃制，16 mm×125 mm 具塞。 7.13 高压灭菌器：可以容纳垂直放入的 500 mL 玻璃瓶。注：如使用市场上预先加注培养基的培养皿，7.10 条～7.13 条可以省略。 7.14 菌落计数器：手动或自动的。 7.15 0.2 μm 滤膜：一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚碳酸酯等材料制成。
试剂与标准物质
试剂纯度：分析纯。 4.2 培养基所用琼脂：生化试剂级。 4.3 水：除非另外指出，应符合 GB/T 6682—2008 中三级水的规定。 4.4 金霉素（氯四环素）水溶液：质量浓度 1 g/L。将 0.1 g 金霉素溶解在水中并稀释至 100 mL，通过 0.2 μm 滤膜过滤对其进行杀菌。 4.5 清洁剂溶液：质量分数为 1%。在 990 mL 水中溶解 10 mL 聚氧乙烯（20）山梨醇酐单油酸酯，杀菌消毒处理可以通过 0.2 μm 滤膜过滤或用高压灭菌器在 121 ℃ 消毒 15 min 实现。 4.6 盐酸溶液：浓度为 1 mol/L。 4.7 乳酸水溶液：质量浓度为 100 g/L。在水中溶解 10 g 乳酸，用水稀释至 100 mL，通过 0.2 μm 滤膜过滤对其进行消毒。 4.8 麦芽浸出液琼脂（MEA）制备： 组成：麦芽榨出物 30 g；蛋白胨 5 g；琼脂 15 g；水 1 L。 准备：麦芽榨出物、蛋白胨以及琼脂在 1 L 水中煮沸，使其溶解。使用盐酸（见 8.6）或氢氧化钠（见 8.10）调节 pH 到 5.4±0.2。取其中 250 mL 加入到 500 mL 玻璃瓶（见 7.11）。用高压灭菌器在 121 ℃±2 ℃ 对其进行 10 min 的消毒处理，取出冷却并保持在温度为 47 ℃±2 ℃ 的水浴中。或者，在琼脂冷却到 47 ℃±2 ℃ 时，向每 100 mL 的 MEA 溶液中加入 1 mL 金霉素水溶液，摇动使其混合均匀。如果介质要求的 pH 值为 3.5，则通过添加 10 mL 的乳酸水溶液进行调节。一旦酸化，MEA 将不能重新加热。通过向培养皿中倒入 MEA 形成一个大约 4 mm 厚的膜来制作琼脂平板，允许冷却成型。 注1：MEA 以脱水或预先加注成型的含有抗生素的或不含抗生素的培养基，都可以从不同的制造商处得到。当对购买的脱水 MEA 培养基进行消毒处理时，应根据使用说明进行操作，避免过热。 注2：对使用 MEA 以外的其他培养基，应证明测试样品中的细菌在替代培养基上的生长数量有可比性。 注3：可以选用其他的抗生素，但需要确认抗生素能够抑制酵母菌和霉菌以外的其他细菌的生长。 4.9 1/4 强度林格氏液制备： 组成：氯化钠 2.25 g；氯化钾 0.105 g；氯化钙 0.12 g；碳酸氢钠 0.05 g；水 1 L。 准备：将上述盐组分溶解到 1 L 水中，然后分配 10 mL 到培养管中，通过高压灭菌器在 121 ℃ 消毒 15 min。 注：1/4 强度的林格氏液可以以片剂的形式从市场购买。 4.10 氢氧化钠溶液：质量浓度为 100 g/L。在水中溶解 10 g 氢氧化钠，并稀释至 100 mL。 4.11 胰酪胨大豆琼脂（TSA）制备： 组成：胰蛋白胨 15 g；大豆蛋白胨 5 g；氯化钠 5 g；琼脂 15 g；水 1 L。 准备：把上述组分加入到 1 L 水中，加热使之溶解。取其中的 250 mL 加入到 500 mL 具塞玻璃瓶中（见 7.11），通过高压灭菌器在 121 ℃±2 ℃ 消毒 10 min，取出冷却并保持在温度为 47 ℃±2 ℃ 的水浴中。提取试样进行 pH 值测定，如果 pH 值不在 7.3±0.3 范围内，丢掉此溶液，重新配制新的混合液。培养基琼脂板是通过向培养皿中倒入足量的 TSA 制成一个厚度为 4 mm 的膜，冷却凝固成型制得。 注1：TSA 培养基可以以脱水干燥和预先成型两种形式从市场得到。 注2：对使用 TSA 外的其他培养基，应证明测试样品中的细菌在替代培养基上的生长数量有可比性。 4.12 醇类溶液：质量分数（原文数值〔待核〕（〔原文不清〕））甲醇或异丙醇溶液，用于现场或实验室对设备和器皿的消毒。
关键条件
培养温度：25 ℃±2 ℃（TSA 培养皿倒置培养）。 若试样收集过程系统的温度比标准的细菌繁殖温度高 5 ℃，调节培养箱的温度与环境温度相当可以改善活细菌的回收。 虽然 25 ℃ 适合大部分微生物系统，但当抽取试样的系统温度超过 30 ℃ 时，也可以采用较高的繁殖温度，确定培养温度同抽取试样温度相差不大于 5 ℃ 的范围内进行培养，培养箱应可以将温度控制在设定温度 ±2 ℃ 之内。 培养时间：3 d 后检查 TSA 与 MEA 培养皿中细菌的繁殖情况，继续培养 24 h 后检查 TSA 与 MEA 培养皿中真菌繁殖情况（即细菌 3 d、真菌 5 d）。 水浴温度：47 ℃±2 ℃。 真空源真空度：不超过 -66 kPa（见 7.5.2 注）。
计算与结果
定量指标：CFU/L（每升试样菌落形成单位数）。 计算公式：N = CC × 1000 / V N：每升试样 CFU 的数量； CC：在培养皿中菌落的数量（见 11.4.1）； V：过滤试样的体积，mL。 无菌落时：设定 CC=1，计算 N，报告细菌 <N CFU/L 或真菌数量 <N CFU/L。 多次试验：计算结果的平均值和标准偏差。 缩略语：CFU（菌落形成单位）、HPC（异养菌的平板计数）、MF（薄膜过滤）、MEA（麦芽浸出液琼脂）、TNTC（多不可计）、TSA（胰酪胨大豆琼脂）。 符号：CC（number of colonies on membrane filter，每膜上的菌落数）；V（sample volume filtered, mL，过滤试样的体积，mL）。
引用文件
GB/T 4756 石油液体手工取样法（GB/T 4756—1998，eqv ISO 3170:1988） GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696:1987 MOD） ASTM D3508 水膜过滤类大肠菌群的评价方法 ASTM D5245 微生物分析用清洁的实验室玻璃器皿，试验器皿和设备 ASTM D5259 通过膜过滤过程对肠球菌进行分离和计数的测试方法 ASTM D6469 燃油和燃油系统微生物污染的标准指南 ASTM D7463 燃油中、燃油与水混合体系及燃油携带水体系的微生物系统中三磷酸腺苷含量测试方法 ASTM D7464-08 生物学试验用液体燃料、相关材料和燃料系统元件的手工取样实施规程 ASTM E1326 用于细菌计数的非常规微生物试验的评定指南 IP 385 沸点小于 390 ℃ 的燃油和馏分油中好氧菌含量的测定 过滤和培养方法 注：原文 2 章首列"CB/T 4756"疑为"GB/T 4756"之 〔原文不清〕误，〔待核〕（〔原文不清〕）。
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